(pcr实验室仪器)

　　了解抗结核中药制剂牛贝消核水提取物(3号)及乙醇提取物(4号)的免疫学、一般药理学作用及其安全性,为其制备成中成药制剂提供可靠的实验基础。方法： (1)牛贝消核的免疫学研究：①牛贝消核水提取物及乙醇提取物对正常小鼠免疫学作用的研究：将BALB/c小鼠64只随机分为空白组、微卡菌苗组、牛贝消 核3号低剂量组、牛贝消核3号中剂量组、牛贝消核3号高剂量组、牛贝消核4号低剂量组、牛贝消核4号中剂量组、牛贝消核4号高剂量组。按上述分组以蒸馏 水、牛贝消核3号药物及牛贝消核4号药物连续灌胃小鼠6周,其中微卡菌苗组每2周1次肌肉注射微卡,空白组每2周1次肌肉注射生理盐水,共注射3次。实验 结束后,摘眼球采血并取小鼠脾脏,通过流式细胞术检测正常小鼠全血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例及细胞因子IL-4、IL-6、IFN- γ. TNF-α、IL-17A、IL-10水平,评估小鼠脾脏指数及胸腺指数,通过MTT的方法测定小鼠脾淋巴细胞增殖反应,应用ELISA方法检测脾淋巴细 胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-4的水平,评价牛贝消核对正常小鼠免疫功能的影响。②牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠腹腔巨噬细胞的影响：将 56只BALB/c小鼠随机分为空白组、牛贝消核3号低剂量组、牛贝消核3号中剂量组、牛贝消核3号高剂量组、牛贝消核4号低剂量组、牛贝消核4号中剂量 组、牛贝消核4号高剂量组,按上述分组用蒸馏水、牛贝消核3号药物及牛贝消核4号药物给小鼠连续灌胃4周后,杀鼠收集腹腔巨噬细胞,以EIISA法检测巨 噬细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平；通过PCR方法检测巨噬细胞吞噬卡介菌的能力,从而评估牛贝消核对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。 (2)牛贝消核水提取物及乙醇提取物的一般药理学研究：①牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠神经系统的影响：将KM小鼠随机分为空白组、牛贝消核3号低 剂量组、牛贝消核3号中剂量组、牛贝消核3号高剂量组、牛贝消核4号低剂量组、牛贝消核4号中剂量组、牛贝消核4号高剂量组,按上述分组用牛贝消核3号药 物及牛贝消核4号药物给小鼠连续灌胃7天,最后1次灌胃后30min,分别通过对小鼠一般行为、翻正反射、睡眠时间、镇痛等神经系统的表现观察,从而评价 牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠神经系统的影响；②牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠肝功能的影响：将KM小鼠随机分为空白组、牛贝消核3号低剂量 组、牛贝消核3号中剂量组、牛贝消核3号高剂量组、牛贝消核4号低剂量组、牛贝消核4号中剂量组、牛贝消核4号高剂量组,按上述分组用牛贝消核3号药物及 牛贝消核4号药物给小鼠连续灌胃7天,最后1次灌胃前,小鼠禁食不禁水8h,最后1次灌胃后30min,摘除眼球法采血,于3000rpm离心5min分 离血清,检测小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶和谷氨酰基转移酶的水平,了解肝功能；③牛贝消核水提 取物及乙醇提取物对小鼠肾功能的影响：将KM小鼠随机分为空白组、牛贝消核3号低剂量组、牛贝消核3号中剂量组、牛贝消核3号高剂量组、牛贝消核4号低剂 量组、牛贝消核4号中剂量组、牛贝消核4号高剂量组,按上述分组用牛贝消核3号药物及牛贝消核4号药物给小鼠连续灌胃7天,最后1次灌胃后,将小鼠置于代 谢笼,收集灌胃给药后240min内的尿液,记录尿液容量,进行尿钠、钾分析,然后用摘除眼球法采血,于3000rpm离心5min分离血清,检测血清中 肌酐和尿素氮的水平,分析尿钠、钾,了解肾功能；从而评价牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠肾功能的影响。(3)牛贝消核的急性毒性试验研究：将KM小 鼠随机分为空白组、牛贝消核3号5倍剂量组、牛贝消核3号10倍剂量组、牛贝消核3号20倍剂量组、牛贝消核4号5倍剂量组、牛贝消核4号10倍剂量组、 牛贝消核4号20倍剂量组,以牛贝消核的5倍、10倍、20倍临床剂量灌胃小鼠,给药后连续观察14天,通过观察小鼠体重及一般行为的变化,对心、肝、 脾、肺、肾形态学变化及其脏器指数的评估,研究牛贝消核的急性毒性。结果：(1)牛贝消核的免疫学研究：①牛贝消核水提取物及乙醇提取物对正常小鼠的免疫 学作用：各组小鼠脾脏器指数与胸腺脏器指数,与空白组比较无显著性差异(P>0.05)；各组小鼠脾淋巴细胞经PHA. BCG刺激培养48小时后,各药物组小鼠脾淋巴细胞增殖指数与空白对照组比较均无显著性差异；各组小鼠脾淋巴细胞经PHA刺激培养72小时后,各药物组与 空白对照组比较脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平均无统计学差异；各药物组与空白对照组比较全血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百 分比及细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A. IL-10均无统计学差异。②通过PCR检测Mφ+BCG孔的BCG基因可见明显的扩增条带,而Mφ孔和BCG孔则无明显条带,说明小鼠腹腔巨噬细胞在体 外确实对BCG具有吞噬作用；应用ELISA方法检测巨噬细胞培养上清中细胞因子：在各组内Mφ孔与Mcp+BCG孔比较,IL-6和IL-1p水平均无 显著差异(P>0.05),而Mφ+BCG孔的TNF-a水平显著高于Mφ孔(P<0.05)；Mφ孔和Mφ+BCG孔的IL-6、IL- 1β和TNF-α水平在各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)牛贝消核水提取物及乙醇提取物的一般药理学作用：①牛贝消核水提取物 及乙醇提取物对小鼠一般行为、翻正反射、睡眠时间、镇痛等神经系统表现均未见明显异常；②牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠血清肌酐、尿素氮、谷丙转氨 酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶和谷氨酰基转移酶及尿钠、钾离子等肝、肾功能指标均在正常范围。(3)牛贝消核的急性 毒性试验：各组小鼠体重呈增长趋势,小鼠毛色光泽、活动自如,心、肝、脾、肺、肾等重要脏器指数组间比较,无统计学差异。结论：(1)牛贝消核水提取物与 乙醇提取物对正常小鼠免疫功能无明显影响。(2)牛贝消核水提取物及乙醇提取物对小鼠神经系统、肝肾功能无明显影响。(3)牛贝消核水提取物及乙醇提取物 对昆明种小鼠无急性毒性反应,初步实验证明是安全的。